جدید No picture مشاهده عکس بزرگتر

بیان وتخلیص پروتئين نوترکيب DR2418 داينوکوکوس راديودورانس در اشريشيا کلي

پایان نامه کارشناسی ارشد رشته میکروبیولوژی

فرمت محصول : word

جدید

14,900 تومان

توضیحات

چکیده

زمینه و اهداف: داینوکوکوس رادیودورانس یکی از میکروارگانیسم های مقاوم به پرتو است و می تواند در محیط های خشن به حیات خود ادامه دهد. مطالعات نشان می دهد که چندین پروتئین آنتی اکسیدان و ترمیم کننده DNA در مقاومت بخشی به پرتو نقش دارد. پروتئین DR2418 یکی از پروتئین های تنظیمی مهم در داینوکوکوس رادیودورانس در مقاومت بخشی به پرتو است. هدف از این مطالعه کلونینگ و بیان ژن dr2418 در E. coli و تخلیص پروتئین این ژن می باشد.

روش کار: ژن dr2418 داینوکوکوس رادیودورانس بصورت سنتتیک در وکتور pGEM-B1 ساخته شد و به دنبال آن ژن dr2418 در وکتور بیانی pET21a ساب کلون شد. صحت ساب کلونینگ توسط هضم آنزیمی و توالی یابی تایید شد. ژن dr2418 در E. coli بیان شد و پروتئین نوترکیب DR2418 توسط ژل الکتروفورز پلی اکریل آمید و وسترن بلاتینگ تایید شد.همچنین با استفاده از ستون کروماتوگرافی جذبی این پروتئین تخلیص گردید.

نتایج: پلاسمید pET21a حاوی ژن dr2418 به همراه برچسب هسیتیدینی در قسمت C-ترمینال بطور موفقیت آمیز ساخته شد. هم چنین، پروتئین نوترکیب DR2418بصورت داخل سلولی در E. coli ترانسفورم شده تولید ، و تخلیص آن با موفقیت انجام شد.

نتیجه گیری: نتایج این مطالعه نشان داد که پروتئین rDR2418 می تواند به عنوان یک کاندید مناسب پروتئین مقاوم به پرتو در نظر گرفته شود. بااین حال، خاصیت مقاومت به پرتو پروتئین DR2418 باید در سیستم های پروکاریوتی و یوکاریوتی آنالیز شود.

فهرست

عنوان                                                                                                                                       صفحه

 

فصل اول : مقدمه و کلیات.. 2

 

فصل دوم : مروری بر تحقیقات انجام شده. 7

2-1-   ترمیم شکستگیهای DNA دورشتهای:11

2-2-   مکانیسم ترمیم شکستگی DNA دورشته ای:12

2-2-2-   اتصال تک رشته (SSA):13

2-2-3-   سنتز Extended وابسته به اتصال رشته ها (ESDSA):13

2-3-   ساختار نوکلئوتید. 14

2-4-   پاسخ سلول های داینوکوکوس متعاقب اشعه گاما:15

2-5-   ژن های دخیل در مقاومت بخشی به اشعه:16

2-6-   منابع میکروبی مقاوم به پرتو فرابنفش و پیامدهای درمانی:18

2-7-   فواید اکستریموفیلهای مقاوم در برابر تابش... 20

2-7-1-   پیامدهای دارویی اکستریمولیت های مقاوم در برابر تابش... 21

2-7-2-   پیامدهای بیوتکنولوژیکی اکستریمولیت های مقاوم در برابر اشعه27

2-8-   محدودیتها و چالشها در دیدگاه پنج ساله30

 

 

فصل سوم : مواد و روشها33

3-1-   آماده سازي وکتور pGEM-B1 حاوي ژن سنتتيکdr2418-opti35

3-2-   مستعدسازي E.coli DH5a. 35

3-3-   تراريختي يا انتقال وکتور حاوي ژن سنتتيک به درون سلول مستعد E.coli DH5a. 36

3-3-1-   استخراج پلاسميد pGEM-B1 حاوي ژن سنتتيک dr2418-opti37

3-3-2-   تاييد استخراج پلاسميد حاوي ژن سنتتيک با روش آگارز ژل الکتروفورز38

3-3-3-   آماده سازي نمونهها براي الکتروفورز38

3-3-4-   رنگ آميزي DNA در ژل آگارز39

3-3-5-   تهيه بافر TBE(10X)39

3-3-6-   طرز تهيه ژل آگارز39

3-3-7-   هضم آنزيمي وکتور pGEM/dr2418 توسط آنزيم NdeI40

3-3-8-   هضم آنزيمي وکتور pGEM/dr2418 توسط آنزيم BamHI41

3-3-9-   تخليص ژن سنتتيک dr2418 از روي ژل. 41

3-3-10-   برش پلاسميد pET-21a توسط آنزيم NdeI43

3-3-11-   برش وکتور pET-21a (هضم شده با NdeI) توسط BamHI43

3-3-12-   ليگاسيون وکتور pET-21a و ژن سنتتيک dr2418. 44

3-3-13-   ترنسفورماسيون pET/ dr2418 در سلول مستعد DH5a. 45

3-4-   توالييابي ژن سنتتيک در pET-21a. 45

3-5-   القاء ساختارهاي بياني pET21a-dr2418 توسط IPTG به منظور توليد پروتئين DR2418 داراي برچسب هيستيدين (His-tagged r-dR2418):46

3-6-   ارزيابي پروتئين DR2418 توليد شده به وسيله الكتروفورز در ژل پلي آكريلاميد (SDS-PAGE)47

3-7-   يكسان سازي غلظت كلي پروتئينها در نمونه هاي قبل و بعد از القا جهت انجام SDS-PAGE. 50

3-8-   شناسائي و تائيد پروتئين His-tagged r-DR2418 با روش Western blot50

3-9-   نگهداري و ذخیره باكتريهاي مولد پروتئين ِDR2418:52

3-10-   بررسي پايداري پلاسميدها (Plasmid stability Test)53

3-11-   خالصسازيپروتئین نوترکیب DR2418 به روش کروماتوگرافی. 53

3-11-1-   ليز سلولي باکتری E.coli54

3-11-2-   آماده كردن ستون. 54

3-11-3-   تزريق نمونه و شستشو. 55

3-11-4-   جدا سازی يپروتئین نوترکیب.. 55

3-11-4-1-   روش دياليز. 56

3-11-5-1- رسم منحنی استاندارد56

3-11-5-2- تهیۀ محلول برادفورد57

3-11-6-   بازيافت و نگهداري ستون. 57

 

فصل چهارم : نتايج.. 58

4-1-   غربال كردن كلني هاي حاوي pGEM-B1 داراي قطعه DR2418:59

4-2-   غربال كردن كلنيهاي E. coli DH5 حاوي pGEM-B1 داراي قطعه59

4-2-1-   تایید پلاسمیدهای استخداج شده با برش آنزیمی NdeI:60

4-2-2-   تایید پلاسمیدهای خطی شده حاوی ژن سنتتیک با هضم آنزیمی BamHI:60

4-3-   جداسازی قطعه از روی ژل و فرایند Ligation:61

4-3-1-   تایید صحت واکنش Ligation ژن در وکتور با روش تعیین توالی:63

4-4-   ترانفسفورم وکتور pET21a حاوی ژن dr2418 به سلول E. coli Origami و ارزيابي بيان پروتئين DR2418:64

4-5-   شناسائي و تائيد پروتئين DR2418 با روش Western BlotWet transfer))64

4-6-   بیان ژن dr2418 در حجم یک لیتر محیط کشت.. 66

4-7- برسی تخلیص پروتئین بر روی ژل SDS_PAGE:67

4-8- نتایج سنجش غلظت پروتئین:67

 

فصل پنجم : بحث و نتيجه گيري....................................................................... 69

 

ضمیمه:76

 

پیشنهادات:84

 

منابع. 85

 

چكيده انگليسي.. 91

نقد و بررسی کاربران

هیچ نقدی هم اکنون وجود ندارد

سبد خرید 0 محصول محصول‌ها (خالی)    

سبد خرید من

هیچ محصولی وجود ندارد

ارسال رایگان! ارسال
0 تومان مجموع

پرداخت مشاهده

خانه

محصولات جدید

خبرنامه