جدید No picture مشاهده عکس بزرگتر

تشخيص برخي از سرووارهاي سالمونلا انتريكا به كمك Multiplex PCR در موارد اسهالي ارجاعي به بيمارستان هاي سبزوار

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته زیست شناسی گرایش میکروبیولوژی

جدید

14,900 تومان

توضیحات

چكيده:

عفونت‌هاي سالمونلايي كه عفونت های غذايي ناميده مي‌شوند، ممكن است توسط هر يك از سرووارها ايجاد شود. معمولا باكتري عامل عفونت در ماده غذايي رشد مي‌كند تا به مقدار قابل توجهي برسد. به اين ترتيب احتمال عفونت افزايش يافته و موجب بروز بيماري در خانواده‌ها و گروه‌هاي بزرگ مي‌شوند. سالمونلا و سروتيپ‌هاي آن منبع مهم آلودگي‌هاي غذايي انسان و عامل پاتوژن بسيار قوي و بيماري‌زا در انسان‌هاست. سالمونلا باكتري گرم منفي، متحرك و باسيلي شكل است كه خصوصيات عمومي خانواده انتروباكترياسه را داراست. امروزه بيش از 2450 سروتيپ سالمونلا شناسايي شده است كه برخي از اين سروتيپ‌ها عامل بيماري‌هايي از قبيل تب تيفوئيد و انتروكوليت در انسان مي‌باشند. در اين مطالعه 50 نمونه مدفوع افراد مبتلا به اسهال از سطح بيمارستان‌هاي شهرستان سبزوار جمع‌آوري گرديد و با رعايت كامل موارد بهداشتي به آزمایشگاه تخصصي دانشگاه آزاد اسلامي واحد سبزوار منتقل شدند. براي جداسازي اوليه از محيط كشت‌هاي بافر پپتون واتر ، سلنیت F براث ،XLD و SS آگار استفاده گرديد. جهت تاييد تشخيص از تست‌هاي بيوشيميايي نظير TSI و اوره آگار و VP، اندول و سيمون سيترات و حرکت استفاده شد. در مطالعه حاضر 10 مورد باكتري سالمونلا با استفاده از روش كشت ميكروبي جدا شد. اين در حالي است كه با استفاده از روش مولكولي Multiplex PCR ، 21 مورد باكتري سالمونلا در نمونه‌ها رديابي گرديد. بنابراين مي‌توان گفت كه روش PCR نسبت به كشت ميكروبي از دقت بالاتري برخوردار است و همچنين روش‌هاي سنتي كشت ميكروبي اغلب زمان‌بر خسته‌كننده و پرهزينه است.

واژه‌هاي كليدي: سالمونلا ، Multiplex PCR، مدفوع

چکیده                                                                                                   

چکیده...............................................................................................................................................2

فصل اول- مقدمه                                                                

   مقدمه وهدف................................................................................................................................4

فصل دوم-مروری بر تحقیقات گذشته                                          

2-1- خصوصیات سالمونلا...........................................................................................................8          

2-1-1- تاریخچه............................................................................................................................8          

2-1-2- طبقه بندی.........................................................................................................................9          

2-1-3- خصوصیات ماکروسکوپیک و میکروسکوپیک...............................................................10        

2-1-4- حساسیت به مواد شیمیایی..............................................................................................12        

2-1-5- ساختار پادگني سالمونلا................................................................................................12        

2-1-6- روش های طبقه بندی....................................................................................................14        

2-1-7- شرایط رشد سالمونلا.....................................................................................................15         

2-1-8- بقا سالمونلا....................................................................................................................17        

2-1-9- منشا سالمونلا.................................................................................................................20        

2-2- آلودگی در انسان................................................................................................................21        

2-2-1- میزان شیوع سالمونلوز در انسان....................................................................................22

2-2-2- علائم سالمونلوز در انسان.............................................................................................23

2-2-3- دوز آلوده کننده.............................................................................................................25

2-2-4- پیشگیری.......................................................................................................................25

2-3- سالمونلوز در حیوانات......................................................................................................26

2-4- سالمونلوز در پرندگان.......................................................................................................27

2-4-1- آلودگی در طیور............................................................................................................27

2-4-2- میزان شیوع...................................................................................................................28

2-5- روش های تشخیص سالمونلا............................................................................................29

2-5-1- روش های کشت.........................................................................................................29

2-5-2- روش سرولوژیکی.......................................................................................................30

2-5-3- روش الایزا................................................................................................................ 30

2-5-4- روش آگلوتيناسيون به كمك لاتكس......................................................................... 31

2-5-5-1-روشPCR.............................................................................................................. 31        

2-5-5-2-   جستجو وآنالیز محصولاتPCR......................................................................... 31

2-5-5-3- بهبود حساسیت و ویژگی تکثیرPCR...................................................................33

2-5-5-4-   اجزای PCR........................................................................................................33

2-5-5-5- سابقه PCR در شناسایی سالمونلا.........................................................................34

فصل سوم:مواد و روش ها .......................................................................................................44          

3-1- وسایل مورد استفاده........................................................................................................45

3-2- مواد مورد استفاده............................................................................................................46

3-3- گرد آوری نمونه های آزمایشی.......................................................................................46

3-4-1- مواد و وسایل لازم برای تهیه محیط...........................................................................46

3-4-2- مواد و وسایل لازم جهت کشت نمونه.......................................................................46

3-4-3- کشت در محیط جامد انتخابی....................................................................................47

3-5- آزمون های بیوشیمیایی...................................................................................................47

3-5-1- کشت در محیط آهن دار سه قندی.............................................................................47

3-5-2- آزمون اوره آز............................................................................................................ 48        

3-5-3- آزمون وژس پروسکوئر..............................................................................................48

3-5-4- آزمون اندول.................................................................................................................49

3-5-5- آزمون سیترات............................................................................................................49

3-5-6- آزمون حرکت..............................................................................................................49

3-6- آزمون رنگ آمیزی گرم..................................................................................................49

   3-6-1- تهیه گسترش روی لام...............................................................................................50

   3-6-2- رنگ آمیزی با کریستال ویوله....................................................................................50

3-6-3- مرحله شستشو...........................................................................................................51

   3-6-4- مرحله اضافه کردن محلول ید....................................................................................51

   3-6-5- مرحله رنگ بری با استفاده از استن – الکل...............................................................51

   3-6-6- رنگ آمیزی با فوشین.................................................................................................51

   3-6-7- خشک کردن لام.........................................................................................................51

 3-6-8-نکات مهمی که هنگام رنگ آمیزی گرم باید مورد توجه قرار گیرد ...........................51

   3-7- استخراج DNA............................................................................................................52                                                                    

3 -7-1-   مواد و وسایل لازم..................................................................................................52

3-8- آزمون PCR................................................................................................................. 52                                                                                              

3-8-1- مواد و وسایل لازم....................................................................................................52

3-8-2- روش کار..................................................................................................................53

3-9- الکتروفورز محصولاتPCR..........................................................................................54                                                                  

3-9-1- مواد و وسائل لازم....................................................................................................54      

3-9-2- تهیه بافر 1x..............................................................................................................55

3-9-3- تهیه ژل آگاروز.........................................................................................................55

3-8-4- بارگذاری محصولات ……………………………….PCR..............................55              

3-10- مشاهده باند های روی ژل..........................................................................................56                                                      

3-10-1- مواد و وسایل لازم.................................................................................................56

فصل چهارم :نتایج                                                                      

4-1 نتایج................................................................................................................................58

4-2- کشت در محیط جامد انتخابی.......................................................................................58

4-2-1- کشت در محیط XLD ............................................................................................58                                                                            

4-2-2-کشت در محیط سالمونلا شیگلا آگار.........................................................................59

4-3-آزمون گرم.......................................................................................................................59

4-4-تست های بیو شیمیایی........................................................................................................60

4-4-1-آزمون.TSI....................................................................................................................60

4-4-2-آزمون اوره آز................................................................................................................60

4-4-3-آزمون ..VP...............................................................................................................61

4-4-5-آزمون اندول...................................................................................................................61

4-4-6-آزمون سیترات............................................................................................................... 61

4-4-7-آزمون حرکت.................................................................................................................62

4-5-استخراج DNA.................................................................................................................63

4-5-1-استخراج توسط KOH 5/0 مولار.................................................................................63

4-6-آزمونPCR........................................................................................................................63

4 -7-نتایج آزمون کای دو.........................................................................................................67

فصل پنجم : بحث و پیشنهادات                                                                            

5-1- بحث................................................................................................................................69

5-2- نتیجه گیری نهایی............................................................................................................77

5-3-پیشنهادات.........................................................................................................................78

 

فهرست شکل ها:

شکل 3-1-1-دستگاه الکتروفورز..........................................................................................45

شکل 3-1-2-دستگاه ترموسایکلر.........................................................................................45

شکل 3-1-3-ترازوی دیجیتال..............................................................................................45

شکل 3-1-4-اتوکلاو............................................................................................................45

شکل 3-1-5-انکوباتور.........................................................................................................45

شکل 3-2 آزمون ………………………………………VP.............................48

شکل 4-1پرگنه های سالمونلای جداشده از نمونه های مدفوعی در محیط ss آگار......................59

شکل 4-2 پرگنه های سالمونلای جداشده از نمونه های مدفوعی در محیط XLD........................59

   شکل 4-3:رنگ آمیزی گرم سالمونلا......................................................................................60

   شکل 4-4 تست TSI نمونه های سالمونلا............................................................................60

   شکل4-5:آزمون اوره آز...........................................................................................................61

شکل 4-6 تست سیترات نمونه های سالمونلا.......................................................................62

شکل4-7:استخراجDNA.....................................................................................................63

   شکل 4-8 نتیجه آزمایش …………………….Multiplex PCR...........................65                                        

 

                                                                          فهرست جدول ها:

جدول 3-1 اجزای واکنشPCR.................................................................................52

   جدول3-2: برنامه دماييPCRدر شناسايي سالمونلا.................................................53

جدول 3-3 مشخصات پرایمر های مورد استفاده..........................................................54

جدول 4-1: جدول دمایی و زمانی ………………………PCR......................64

جدول 4-2 آزمون کای دو...........................................................................................67

 

 فهرست نمودارها:

    نمودار شماره 1-4 درصد آلودگی نمونه های مدفوع به باکتری سالمونلا به روش معمول جداسازی................... 66

نمودار شماره2-4: درصد آلودگی نمونه های مدفوع به باکتری سالمونلا به روشM-PCR........................... 66

نقد و بررسی کاربران

هیچ نقدی هم اکنون وجود ندارد

سبد خرید 0 محصول محصول‌ها (خالی)    

سبد خرید من

هیچ محصولی وجود ندارد

ارسال رایگان! ارسال
0 تومان مجموع

پرداخت مشاهده

خانه

محصولات جدید

خبرنامه